操作步骤/方法
1 引物设计原则是： 2 引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp。 3 引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近。 4 引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合。 5 ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3’端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3’末端双链的ΔG值在0–2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0。 6 错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的。 7 Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段。 8 引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生。 9 3’端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3’端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配。 10 以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内。 11 模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物。 12 在DNA测序和PCR中最好用5’末端稳定（GC含量多），而3’端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。 13 引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。 14 对引物的修饰一般在5’端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。